典型的心肌梗死根据病史来诊断，由开始并演变的心电图证实，为酶的动态变化所支持。然而有些病例不太可能作出明确诊断，临床表现很典型或强烈提示为心肌梗死，但心电图和酶学分析不支持诊断，这些病人将归类于可能的心肌梗死，其中一部分可能有小面积的心肌梗死。
主诉为胸痛的年龄＞35岁的男性及＞50岁的女性都应考虑为心肌梗死，但必须与下列原因的疾病鉴别：肺炎，肺栓塞，心包炎，肋骨骨折，肋骨软骨分离，食管痉挛，创伤或劳累后胸壁肌肉触痛，主动脉夹层，肾结石，脾梗塞或各种各样的腹部疾患。病人常把心肌梗死的疼痛认为是消化不良，这样由于经常并存有裂孔疝，消化性溃疡或胆囊疾病，而使评价很困难。虽然嗳气或制酸剂常能缓解心肌梗死的疼痛，但这种缓解通常是短暂或不完全的。
心电图 对于可疑急性心肌梗死者，最重要的实验室检查就是心电图。急性透壁性心肌梗死（Q波梗死），第一份心电图常有诊断意义，表现为损伤区导联上异常深的Q波和ST段升高，或者心电图有明显的ST段抬高或压低以及T波倒置和加深，而无异常Q波。新出现的左束支传导阻滞可能是近期心肌梗死的标记。首次12导联心电图对治疗选择起重要作用（ST段抬高者溶栓疗法有益-见下文治疗）。如有特征性症状存在，心电图上ST段抬高诊断心肌梗死特异性为90%，敏感性为45%.连续追踪显示心电图逐渐演变成稳定的更趋正常的模式或几天内出现异常Q波可证实最初急性心肌梗死的印象。由于非透壁性（非Q波）梗死常发生于内膜下或中层心肌，故其心电图上没有诊断性的Q波出现，常常仅产生程度上不断变化的ST段和T波异常。然而，如重复心电图检查是正常的，则不可能诊断为急性心肌梗死。疼痛缓解时，心电图正常不能排除不稳定性心绞痛，后者可以急性心肌梗死而告终。
血液检查 常规检查显示与组织坏死相对应的异常，因而，12小时后ESR加快，WBC中度升高，WBC分类计数示核左移。
CK-MB是CK的心肌成分，心肌坏死6小时内出现于血液中，水平升高持续36~48小时。虽然其他组织也有少量的CK-MB，MB占40%以上的CK升高如临床表现疑有心肌梗死则具有诊断意义。入院时及最初24小时内每6~8小时常规测定CK-MB，可确定或排除诊断。实际上24小时内CK-MB均正常可排除心肌梗死。梗死心肌也释放肌红蛋白和收缩蛋白肌钙蛋白-T和肌钙蛋白-I，肌钙蛋白-T和肌钙蛋白-I似乎是心肌损伤更敏感的标记物，可取代传统的CK-MB分析，用于有胸痛而缺乏有诊断意义的心电图改变的病人的早期分类，某些不稳定性心绞痛也释放肌钙蛋白，其活性水平可预测将来的不良事件。
心肌显像 有两种技术可用于心肌梗死显像；99m锝焦磷酸盐在近期（≤3~4天）梗死的心肌中积聚，相反，201铊以钾的方式积聚在存活心肌的细胞间隙，并按血流量分布。然而，显像慢且昂贵，暴露于射线，对心肌梗死的诊断和治疗仅有临界的益处。
超声心动图可用于评价室壁运动，心室血栓的存在，乳头肌断裂，室间隔破裂，心室功能及前壁心梗腔内血栓的存在。如心肌梗死的诊断尚未肯定，超声心动图上LV室壁运动异常的检出可确定心肌损伤的存在，推测是由于近期或陈旧性心肌梗死所致。
右心导管检查 用球囊漂浮导管（Swan-Ganz）测定右室，肺动脉和肺楔压有助于心肌梗死并发症（如重度心衰，低氧，低血压）的处理，用指示剂稀释技术可确定心排血量。心导管检查的并发症和其他细节参见第198节。